骨胶原蛋白壳聚糖共混膜中分子间作用红外光谱(5)

图5 共混膜在波数900~1480 cm–1区域的分峰拟合图Fig.5 Curve-fitting results of band of blend films in the region of 900~1480 cm–1

3 结 论

本研究采用红外光谱分峰拟合和二维红外相关分析法明确了胶原蛋白-壳聚糖共混膜的分子间相互作用情况。结果表明：

1）添加壳聚糖后，共混膜红外光谱的酰胺A 向短波迁移2 cm–1，峰形由强的尖锐峰变成弱的宽钝峰，酰胺B峰强度增大，酰胺I向长波迁移2 cm–1，胶原蛋白的二级结构组成发生改变，酰胺III区域主要吸收峰位置发生迁移，表明胶原蛋白与壳聚糖分子间形成了氢键作用；酰胺II分峰拟合结果表明壳聚糖的-NH2基团质子化形成-NH3+，表明胶原蛋白和壳聚糖之间形成了静电相互作用；

2）成膜过程中，胶原蛋白二级结构中α-螺旋含量减少，β-折叠和 β-转角含量增加，表明胶原蛋白结构更加舒展，活性基团暴露；

3）二维相关分析结果表明，共混膜成膜过程中胶原蛋白 C=O基团构象率先改变，此外 N-H、C-N、-NH、-NH3+、-NH2基团和多糖骨架C–O–C等基团的构象也受到了成膜组分混合比例的影响，表明胶原蛋白与壳聚糖分子间相互作用强度与胶原蛋白和壳聚糖两者的混合比例有关。

0 引 言近年来，塑料包装材料的不可降解性和不可循环性已经引起了严重的环境问题。同时，随着消费者对营养健康的关注，研究开发生物可降解膜已经成为食品包装领域的重要趋势。胶原蛋白具有良好的成膜特性和生物相容性，是可食性生物膜的重要材料来源。胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，占动物总蛋白的 30%左右，主要存在于动物的肌腱、软骨、骨和皮等结缔组织中[1-3]。我国畜禽骨副产物产量巨大，但加工利用率低，造成了极大了资源浪费。胶原蛋白作为骨的主要组成物质，具有极高的可开发利用价值。另外，胶原蛋白膜可以作为抗氧化剂和抗菌剂的载体应用于食品包装中[4-5]。然而，纯胶原蛋白膜的表面粗糙、易变性且机械特性较差，一定程度上限制了它的应用。壳聚糖是甲壳素经脱乙酰化反应后得到的一种天然多聚物，含量丰富，具有良好的抑菌性和成膜性和机械特性[6]。目前研究发现，胶原蛋白和壳聚糖共混膜的成膜特性优于单一组分膜，使得共混膜更适用于食品包装[7-8]。在成膜过程中，胶原蛋白和壳聚糖可能通过分子构象变化和分子间相互作用形成复杂的复合物。胶原蛋白的-OH、-NH2、-COOH基团等可能与壳聚糖的-NH2和-COOH等基团形成分子间氢键相互作用[9]。壳聚糖的-NH2在酸性环境下容易被质子化形成-NH3+，并与呈阴离子性的胶原蛋白形成静电作用。因此，明确成膜过程中胶原蛋白和壳聚糖分子间的相互作用情况对优化共混膜的成膜特性十分重要。目前，已有研究通过共混膜红外光谱中吸收峰峰位和强度变化，初步探讨了成膜过程中 2种物质的相互作用情况，并推断胶原蛋白与壳聚糖分子间形成了氢键和静电相互作用[9-11]。二维红外相关光谱法是将数学相关分析技术用于红外光谱中，研究在外源因素的干扰下分子内官能团间相互作用和分子间相互作用的方法[12-13]。二维红外相关光谱还可以获得分子中官能团对外扰因素的敏感程度和响应顺序。二维红外相关光谱法被广泛用于物质的结构变化和分子间相互作用研究等[13-16]。然而，目前通过二维红外相关光谱法研究骨胶原蛋白和壳聚糖之间的相互作用情况的研究报道较少。因此，本文以骨胶原蛋白和壳聚糖混合比例为外扰，通过分峰拟合和二维相关分析方法，明确成膜过程中骨胶原蛋白与壳聚糖分子间的相互作用情况，为共混膜分子间相互作用的应用提供新思路，进而为胶原蛋白-壳聚糖膜的生产应用提供理论基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂羊骨购买自内蒙古锡林郭勒盟额尔敦肉类食品有限公司；胃蛋白酶（美国Amresco公司）；壳聚糖（国药集团化学试剂有限公司）；甘油（美国 Amresco公司）；乙酸、氯化钠（国药集团化学试剂有限公司 仪器与设备冻干机（北京四环科学仪器厂有限公司 LGJ-25型冷阱温度：≤-62 ℃极限真空度：≤10 Pa（空载））磁力搅拌器（EMS-19天津欧诺仪器仪表有限公司搅拌容量(10-3000)×6（10 L），加热功率(50-300)×6）烘箱（宁波江南仪器厂 控温范围：室温+10~200 ℃温度波动：±1 ℃）水浴锅（上海精宏实验设备有限公司 DK-S26 控温范围+5～100 ℃温度波动：±1 ℃）超声波清洗器（昆山禾创超声波仪器有限公司KH7200DE 超声频率40控温范围 常温~80 ℃）红外光谱仪（德国Bruker Tensor 27分辨率：0.5 cm–1光谱范围：7500~370 羊骨胶原蛋白提取骨胶原蛋白提取方法参考Ruili zhang等[1]的方法，修改提取时的料液比和胃蛋白酶用量。新鲜乌珠穆沁羊骨购买自内蒙古锡林郭勒盟，–20℃保存。清洗破碎后，进行除杂蛋白、脱脂和脱钙处理。采用胃蛋白酶-乙酸法提取羊骨胶原蛋白，取脱钙骨粉以1:10（w/v）料液比置于胃蛋白酶-乙酸溶液中，胃蛋白酶与骨粉的用量比为20 U/g，磁力搅拌3 d提取骨胶原蛋白。通过盐析和透析纯化并冻干得到酶溶性羊骨?胶原蛋白-壳聚糖共混膜制备取骨胶原蛋白和壳聚糖分别溶于0.5 M乙酸中，制成浓度为 1.5%骨胶原蛋白和 1.5%壳聚糖（w/v）的成膜液，搅拌均匀。将骨胶原蛋白（BC）和壳聚糖（CS）的乙酸成膜液分别按照100:0、60:40、50:50、40:60和0:100体积比混合均匀，40 ℃恒温水浴搅拌30 min。冷却后，加入 25%（以溶质质量计）的甘油作为增塑剂，搅拌均匀后超声脱气30 min形成铸膜液。将铸膜液均匀倒在塑料成膜器内，50 ℃干燥18 h，再于室温放置6 h后揭膜。膜样品置于25 ± 0.5 ℃、50% ± 5%相对湿度（饱和溴化钠溶液）的干燥器中保存待分析。按照不同混合比例，各处理组分别命名为：100 BC:0 CS、60 BC:40 CS、50 BC:50 CS、40 BC:60 CS和0 BC:100 胶原蛋白-壳聚糖共混膜红外光谱胶原蛋白-壳聚糖共混膜覆盖在红外光谱晶胞上，压紧，25 ℃下采用全反射傅里叶变换红外光谱（Total reflectance fourier transform infrared spectroscopic，ATRFTIR）法进行测定胶原蛋白-壳聚糖共混膜在波数 600~4000 cm–1范围内的红外光谱，扫描分辨率为0.5 cm–1，以空气为空 胶原蛋白-壳聚糖共混膜分峰拟合参考倪娜[17]、Barth[18]、Shudong H.[19]等的研究，使用 Peaktit 4.12软件对胶原蛋白-壳聚糖共混膜在800~1700 cm–1波长范围内的图谱进行分峰拟合。根据酰胺I区域各子吸收峰的峰位归属情况，计算胶原蛋白各个二级结构（α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲）的相对百分含量 胶原蛋白-壳聚糖共混膜二维红外相关分析采用2D Shige软件（KwanseiGakuin）绘制以等高线表征的二维相关图谱。根据二维相关分析读谱规则[15]，确定各基团响应顺序。2 结果与分析2.1 骨胶原蛋白-壳聚糖共混膜红外光谱如图 1所示为胶原蛋白-壳聚糖共混膜在 600~4000 cm–1波数范围内的红外光谱图。通常，酰胺A区域最大吸收峰位于波数3400~3440 cm–1之间，主要涉及N-H和O-H伸缩振动。当N-H与氢键缔合后，吸收峰向短波位移[20]。纯骨胶原蛋白膜酰胺 A最大吸收峰位于波数3292 cm–1，表明纯骨胶原蛋白膜分子中含有大量氢键。当壳聚糖添加量为60%时，酰胺A最大吸收峰向短波迁移至波数 3290 cm–1处，峰形由强的尖锐峰变成弱的宽钝峰，可能是添加壳聚糖后，O-H键振动峰与N-H键振动峰重叠，并增强了成膜组分间的氢键作用。添加壳聚糖后，共混膜在波数 3080 cm–1处的肩峰向长波方向迁移4 cm–1。酰胺B区域涉及2927 cm–1处的CH2不对称伸缩振动和2875 cm–1处的CH2对称伸缩振动[10]。随着壳聚糖添加量增大，羊骨胶原蛋白-壳聚糖共混膜在2927 cm–1处吸收峰强度逐渐增大，基团振动强度增大，可能与壳聚糖分子中CH2基团振动有关。图1 羊骨胶原蛋白-壳聚糖共混膜红外光谱Fig.1 Infrared spectra of bones collagen-chitosan blend films注：BC为骨胶原蛋白，CS为壳聚糖，数字为两者混合体积比例。下同。Note：BC means Bone collagen，CS means chitosan and numbers indicated the volume ratio of blend. The same below.机械特性结果显示添加壳聚糖能够显著提高骨胶原蛋白膜的拉伸强度，且随着壳聚糖添加量增大，骨胶原蛋白-壳聚糖共混膜的拉伸强度先升高后略微降低。当骨胶原蛋白与壳聚糖添加比例为 3∶2时，羊骨胶原蛋白-壳聚糖膜的拉伸强度最大，推测此时两者的相互作用力最强。壳聚糖分子排列在胶原蛋白分子间，并且与胶原蛋白分子间通过氢键结合，可替代胶原蛋白的三螺旋结构的作用，提高了膜的拉伸强度[9]。当壳聚糖含量进一步增加时，少量存在的胶原蛋白削弱了壳聚糖分子间相互作用力，损害了壳聚糖膜的完整结构，导致共混膜的拉伸强度降低。整体来看，随着壳聚糖含量增加，骨胶原蛋白-壳聚糖膜的断裂延伸率逐渐降低。少量壳聚糖的加入（小于50%）对胶原蛋白膜的断裂延伸率无显著影响。而壳聚糖含量较高时，壳聚糖分子间形成网络结构，以及与胶原蛋白之间形成的相互作用降低了成膜分子的流动性，导致混合膜的断裂延伸率降低。Gómez-Estaca等[7]研究发现添加壳聚糖后，金枪鱼皮明胶-壳聚糖共混膜的拉伸强度从8~10 MPa升高到18 MPa，断裂延伸率降低了11%~14%。Jeya Shakila等[8]也报道，添加壳聚糖后，明胶膜的拉伸强度增大，但断裂延伸率下降。同时，他们也发现不同来源的胶原蛋白膜拉伸强度不同，哺乳动物源胶原蛋白膜拉伸强度大于鱼源胶原蛋白。红外光谱图中波数1600~1700 cm–1波数范围内的吸收峰为酰胺I区域，涉及多肽链骨架上的C=O伸缩振动[21]和壳聚糖乙酰基上的C=O伸缩振动。壳聚糖脱乙酰化反应后，分子侧链中-NH2基团取代了-NHCOCH3基团，因此壳聚糖脱乙酰化程度越高，壳聚糖酰胺I吸收峰强度越小[22]。本研究中，纯壳聚糖膜酰胺I区域仅在波数1640 cm–1附近存在一个较小的肩峰，表明本研究中壳聚糖的脱乙酰化程度较高，分子侧链主要为 NH2基团。纯骨胶原蛋白膜酰胺I最大吸收峰位于波数1633 cm–1处，当壳聚糖添加量大于50%时，酰胺I区域的最大吸收峰向长波方向迁移至波数1635 cm–1处，推测可能是壳聚糖与胶原蛋白形成了分子间相互作用，改变了胶原蛋白的二级结构。由于蛋白质酰胺 I区域的吸收峰特征极少受到蛋白质侧链构象的影响，因此其主要用于分析蛋白质的二级结构[18]。蛋白质各二级结构在酰胺I区域出现的顺序为：α-螺旋1645~1659 cm–1、β-折叠或伸展结构 1620~1640 cm–1、β-转角 1660~1700 cm–1、无规则卷曲 1640~1644 cm–1[23]。对酰胺 I区域进行分峰拟合分析，结合吸收峰归属情况证实，共混膜中骨胶原蛋白的二级结构主要为 β-折叠。天然胶原蛋白为三螺旋结构，二级结构主要是 α-螺旋，受热易发生变性，三螺旋结构域解旋，分子伸展[3,24]。共混膜中胶原蛋白二级结构变化可能是成膜工艺导致的，如成膜组分的共混温度和干燥温度。如图 2所示，加入壳聚糖后，胶原蛋白的α-螺旋含量减少，β-转角和折叠含量增加，表明加入壳聚糖后，胶原蛋白的分子结构更加舒展，有利于分子间相互作用的形成，分子相容性较好，易混合。图2 共混膜中胶原蛋白二级结构相对百分含量Fig.2 Relative percent content of secondary structure of bone collagen in blend films波数1550~1600 cm–1范围内吸收峰为酰胺II区域，主要涉及 N-H弯曲振动（40%~60%）和 C-N伸缩振动（18%~40%）[25]。纯骨胶原蛋白膜酰胺II最大吸收峰位于波数1541 cm–1处。添加壳聚糖后，共混膜的最大吸收峰迁移至波数1535 cm–1处（50BC:50CS），纯壳聚糖膜酰胺II最大吸收峰位于波数1552 cm–1处。壳聚糖分子侧链的-NH2基团可通过质子化形成-NH3+[10]，因此酰胺 II最大吸收峰位置的改变可能与混合物中 N-H振动类型和强度的变化有关。如图3所示，酰胺II分峰拟合结果表明，共混膜酰胺II区域包括6个子吸收峰：1501、1518、1539、1554、1573 和 1583 cm–1。其中，1518 cm–1归属于-NH3+对称变角振动，1539 cm–1归属于N-H弯曲振动和C-N伸缩振动，1583 cm–1归属于NH2振动[22]。与单一组分膜相比，混合膜1518 cm–1吸收峰强度减小，1539 cm–1吸收峰强度增大，推测原因是壳聚糖的-NH3+基团在成膜过程中参与了分子间静电作用的形成。图3 共混膜酰胺II区域分峰拟合图Fig.3 Curve-fitting figures of amide II band of blend films注：图中最高峰为红外吸收峰，其余为其分峰拟合后的子吸收峰。下同。Note：The highest peak is the infrared absorption peak in all figures, others are subabsorption peak after curve-fitting. The same below.随着壳聚糖含量增加，共混膜在波数1450 cm–1（涉及CH2弯曲振动）、1403 cm–1（COO—对称伸缩振动）[26]处的吸收峰强度减弱，且波数 1450 cm–1吸收峰（100BC:0CS）迁移至波数 1448 cm–1处（40BC:60CS）。游离COO—归属于胶原蛋白分子，使得胶原蛋白分子呈现阴离子特性，推测1403 cm–1吸收峰强度的改变可能与共混膜中分子间静电作用形成有关。波数1334 cm–1处最大吸收峰归属 CH2摇摆振动，该峰位置随着壳聚糖含量增加无显著变化。壳聚糖添加量为60%时，在波数1377 cm–1出现肩峰，归属于壳聚糖CH2弯曲振动。胶原蛋白酰胺 III 区域涉及到的基团和特征吸收峰较多，通常包括C-N伸缩振动、酰胺键N-H弯曲振动以及Gly骨架和Pro侧链上的CH2摇摆振动[18,27]，主要用于分析蛋白质分子间及其与其他分子间的相互作用力。壳聚糖在波数~1200 cm–1内主要归属于多糖链的骨架振动，主要涉及-C-O-C-不对称伸缩振动[28]。纯骨胶原蛋白膜在波数1236 cm–1处的吸收峰归属于N-H弯曲振动和C-N伸缩振动。随着壳聚糖添加量增大，共混膜在波数1236 cm–1处吸收强度不断减小，吸收峰位置红移至1240 cm–1（40BC:60CS），纯壳聚糖膜酰胺III最大吸收峰位于波数1261 cm–1处。前人研究认为，波数1238 cm–1和1240 cm–1处最大吸收峰吸光度的比值越接近1.0，胶原蛋白的三螺旋结构域保持越完整[29]。本研究中羊骨胶原蛋白-壳聚糖共混膜在2处吸光度的比值均远离1.0，说明膜结构中胶原蛋白的三螺旋结构被破坏，这与酰胺 I分峰拟合结果一致。由于本研究中成膜温度在50℃以下，因此骨胶原蛋白的单肽链未发生降解。波数1163 cm–1处的吸收峰归属于COO-C不对称伸缩振动[30]，纯骨胶原蛋白膜在此处的吸收峰极小，随着壳聚糖添加量增大，该处吸收峰强度增大，逐渐蓝移至波数1157 cm–1处（40BC:60CS），纯壳聚糖膜位于波数1151 cm–1，表明COO-C在成膜过程中参与了分子间作用力的形成。随着壳聚糖含量增加，共混膜在波数1203 cm–1处的吸收峰强度减弱。波数1035 cm–1处的强且尖锐吸收峰归属于分子骨架上-C-O-C-伸缩振动[31-32]。随着壳聚糖含量增加，1035 cm–1处吸收峰强度增强，1080 cm–1处的吸收峰与1035 cm–1重叠。综上所述，根据不同波数处吸收峰强度和位置的变化可推断，在共混膜成膜过程中，胶原蛋白与壳聚糖分子间形成氢键和静电相互作用，并且其作用强度与胶原蛋白和壳聚糖两者的混合比例有 共混膜二维红外相关分析为进一步明确胶原蛋白和壳聚糖分子间相互作用力的详细信息，以壳聚糖添加量为外扰，对共混膜在波数2850~3350 cm–1、1200~1700 cm–1和 850~1300 cm–1波长范围内的红外光谱进行二维相关分析。研究在外源因素的干扰下分子内官能团间相互作用和分子间相互作用的方法[12,13]。根据二维红外相关光谱中同步光谱（Φ）和异步光谱（Ψ）中2个波长变化的正负关系，可以获得分子中官能团对外扰因素的敏感程度和响应顺序。根据二维相关光谱读谱规则[12,15,33]，同步光谱中，自相关峰的强度大小代表在相关周期中光强度动态涨落的总程度，说明这些振动峰对应的基团随浓度的改变而发生变化[33]。自相关峰代表吸收峰带对壳聚糖组分增加的敏感程度，同步交叉峰是不同官能团振动同时取向产生的，这种微观结构的同步性表明基团之间有很强的协同作用或可能存在强烈的相互作用。所以，骨胶原蛋白-壳聚糖共混物的同步交叉峰存在以下关系：Φ[ν（骨胶原蛋白），ν（骨胶原蛋白）] > 0，Φ[ ν（壳聚糖），ν（壳聚糖）] > 0，Φ[ ν（骨胶原蛋白），ν（壳聚糖）] < 0，Φ[ ν（壳聚糖），ν（骨胶原蛋白）] < 0。利用这种规律可以鉴别出各谱峰的具体归属。异步光谱可以为同步光谱提供一些补充信息，二维异步相关谱没有自相关峰，只有一系列关于主对角线反对称的交叉峰，代表了在ν1和ν2处的光谱强度变化顺序或变化的不同步性。本文所有异步相关峰均由于骨胶原蛋白-壳聚糖共混物分子构象和分子间相互作用的变化引起，因为简单的组分浓度变化只会导致吸收强度的增减，不会形成异步峰[13,14]。根据Noda规则[12]可以判断出随着壳聚糖组分含量的增加，波长ν1和ν2的变化顺序。当 Φ（ν1，ν2）>0，Ψ（ν1，ν2）<0，或 Φ（ν1，ν2）<0，Ψ（ν1，ν2）>0时，ν1处强度变化滞后于ν2处强度变化；当 Φ（ν1，ν2）>0, Ψ（ν1，ν2）>0，或 Φ（ν1，ν2）< 0，Ψ（ν1，ν2）<0时，ν1处强度变化优先于ν2处强度变化。如图4所示，随着胶原蛋白含量减少，波数3292和2927 cm–1吸收峰强度均减小，在二维相关光谱中，2处吸收峰变化具有同向性，因此二维相关光谱中，2处的吸收峰归属于胶原蛋白基团，且N-H伸缩振动首先参与新氢键网络结构的形成。图4 共混膜在二维红外相关光谱Fig.4 Two-dimensional infrared correlation spectra of blend films注：图中a、b是波数2850~3350 cm–1范围内二维红外相关光谱，其中a是同步光谱，b是异步光谱；c、d是波数1200~1700 cm–1范围内二维红外相关光谱，其中c是同步光谱，d是异步光谱；e、f是波数850~1300 cm–1范围内二维红外相关光谱，其中e是同步光谱，f是异步光谱；图中横纵坐标均为波数/cm–1Note: Figure a，b were two-dimensional infrared correlation spectroscopy in the region of 2850~3350 cm–1, and a was synchronous spectrum, b was asynchronous spectrum. Figure c，d were two-dimensional infrared correlation spectroscopy in the region of 1200~1700 cm–1, and c was synchronous spectrum,d was asynchronous spectrum. Figure e，f were two-dimensional infrared correlation spectroscopy in the region of 850~1300 cm–1, and e was synchronous spectrum, f was asynchronous spectrum. Tbscissa and ordinate indicated wavenumber/cm–1共混膜在波数1633 cm–1处出现强自动吸收峰，说明C=O基团对混合比例变化响应敏感，进一步证明，添加壳聚糖后胶原蛋白分子结构舒展，二级结构中 α-螺旋含量减少，β-转角和折叠含量增多，有利于与壳聚糖分子形成分子间相互作用。随着胶原蛋白含量减少，酰胺I吸收峰强度减小，且脱乙酰化程度较高的壳聚糖分子侧链主要为-NH2基团，说明C=O基团归属于胶原蛋白。因此，根据二维相关光谱读谱规则，波数1452、1334和1236 cm–1处红外振动吸收峰也属于胶原蛋白基团，且波数1633 cm–1优先于波数1452、1334和1236 cm–1处吸收峰变化，表明成膜过程中，胶原蛋白二级结构的变化优先于CH2、N-H和C-N等基团构象的变化。如图5所示为共混膜酰胺III区域分峰拟合图，由图5可知，纯胶原蛋白膜酰胺II区域包括3个主要子吸收峰：1204、1236 和 1274 cm–1，其中1236和 1274 cm–1为 N-H和C-N不同的空间构象。添加壳聚糖后，1204 cm–1子吸收峰强度逐渐减少，为Hyp特征振动吸收峰[34]。1236和1274 cm–12基团构象逐渐转变成 1261 cm–1处。波数1100-900 cm–1范围主要为多糖C–O–C骨架振动的红外吸收峰。二维相关光谱证明，成膜过程中，壳聚糖的C–O–C参与了分子间相互作用的形成。因此，根据表1判断，成膜过程中各基团的变化顺序为：1633 cm–1> 1448 cm–1>1236 cm–1> 1068 cm–1> 997 cm–1> 896 cm–1。除上述相关吸收峰外，在波数1200-1700 cm–1（d）异步光谱中，存在正吸收峰：(1539, 1573)、(1452, 1510)、(1274, 1502)、(1236, 1573)、(1236, 1510)、(1236, 1404)、(1204, 1510)，和负吸收峰：(1573, 1639)、(1510, 1639)、(1510, 1539)、(1404, 1452)、(1377, 1515)、(1377, 1402)、(1310, 1639)、(1404, 1525)。在波数 850-1300 cm–1（f）异步光谱中，存在正吸收峰：(1078, 1113)、(1010, 1113)、(1010, 1035)、(962, 1035)、(920, 1035)、(860, 1035)，和负吸收峰：(1151, 1236)、(1078, 1113)、(1035, 1197)、(1035,1082)、(1010, 1236)、(1010, 1197)、(1010, 1151)、(995,1151)、(966, 1082)、(945, 1082)、(910, 1261)、(896, 1151)、(896, 1082)。以上相关吸收峰主要涉及酰胺II区域N-H键（包括-NH、-NH3+、-NH2基团）和多糖骨架 C–O–C等基团振动。壳聚糖骨架C–O–C键振动可能是壳聚糖空间构象变化所引起的。（1404, 1525）异步相关峰证明，胶原蛋白的 COO–和-NH3+形成了静电相互作用。由于异步相关峰是由骨胶原蛋白-壳聚糖共混物分子构象和分子间相互作用的变化引起，因此二维异步相关光谱证实，成膜过程中胶原蛋白和壳聚糖分子基团间形成了氢键和静电相互作用。表1 成膜组分基团二维相关光谱中响应顺序Table 1 The order of band intensity variations of film components注：col表示骨胶原蛋白，cs表示壳聚糖Note: col represents bone collagen, cs represents chitosan.序号No.同步光谱Synchronous spectrum异步光谱Asynchronous spectrum归属Arrangement顺序特征Order 1 Φ(3076, 3292)>0 Ψ(3076, 3292)>0 (col, col) 3076 before 3292 cm–12 Φ(2927, 3292)>0 Ψ(2927, 3292)<0 (col, col) 2927 after 3292 cm–13 Φ(1452, 1633)>0 Ψ(1452, 1633)<0 (col, col) 1452 after 1633 cm–14 Φ(1404, 1639)>0 Ψ(1404, 1639)<0 (col, col) 1404 after 1633 cm–15 Φ(1334, 1633)>0 Ψ(1334, 1633)<0 (col, col) 1334 after 1633 cm–16 Φ(1236, 1633)>0 Ψ(1261, 1633)<0 (col, col) 1236 after 1633 cm–17 Φ(1236, 1448)>0 Ψ(1261, 1448)<0 (col, col) 1236 after 1448 cm–18 Φ(1236, 1334)>0 Ψ(1236, 1334)>0 (col, col) 1236 before 1334 cm–19 Φ(1236, 1274)>0 Ψ(1236, 1261)>0 (col, col) 1236 before 1261 cm–110 Φ(1068, 1274)<0 Ψ(1068, 1274)<0 (cs, col) 1068 after 1274 cm–111 Φ(997, 1274)<0 Ψ(1004,1274)<0 (cs, col) 1004 after 1274 cm–112 Φ(896, 1274)<0 Ψ(896,1274)<0 (cs, col) 896 after 1274 cm–113 Φ(1204, 1234)>0 Ψ(1204, 1261)>0 (col, col) 1204 before 1261 cm–114 Φ(1068, 1234)<0 Ψ(1068, 1234)<0 (cs, col) 1068 after 1234 cm–115 Φ(1043, 1261)<0 Ψ(1043, 1261)<0 (cs, col) 1043 after 1261 cm–116 Φ(997, 1234)<0 Ψ(1004, 1234)<0 (cs, col) 997 after 1234 cm–117 Φ(896, 1234)<0 Ψ(896, 1234)<0 (cs, col) 896 after 1234 cm–118 Φ(1031, 1152)>0 Ψ(1031, 1152)<0 (cs, cs) 1031 after 1152 cm–119 Φ(1004, 1068)>0 Ψ(997, 1068)<0 (cs, cs) 997 after 1068 cm–120 Φ(896, 1068)>0 Ψ(896, 1068)<0 (cs, cs) 896 after 1068 cm–121 Φ(914, 1043)>0 Ψ(922, 1043)>0 (cs, cs) 922 before 1043 cm–122 Φ(896, 997)>0 Ψ(896, 1008)<0 (cs, cs) 896 after 997 cm–1图5 共混膜在波数900~1480 cm–1区域的分峰拟合图Fig.5 Curve-fitting results of band of blend films in the region of 900~1480 cm–13 结 论本研究采用红外光谱分峰拟合和二维红外相关分析法明确了胶原蛋白-壳聚糖共混膜的分子间相互作用情况。结果表明：1）添加壳聚糖后，共混膜红外光谱的酰胺A 向短波迁移2 cm–1，峰形由强的尖锐峰变成弱的宽钝峰，酰胺B峰强度增大，酰胺I向长波迁移2 cm–1，胶原蛋白的二级结构组成发生改变，酰胺III区域主要吸收峰位置发生迁移，表明胶原蛋白与壳聚糖分子间形成了氢键作用；酰胺II分峰拟合结果表明壳聚糖的-NH2基团质子化形成-NH3+，表明胶原蛋白和壳聚糖之间形成了静电相互作用；2）成膜过程中，胶原蛋白二级结构中α-螺旋含量减少，β-折叠和 β-转角含量增加，表明胶原蛋白结构更加舒展，活性基团暴露；3）二维相关分析结果表明，共混膜成膜过程中胶原蛋白 C=O基团构象率先改变，此外 N-H、C-N、-NH、-NH3+、-NH2基团和多糖骨架C–O–C等基团的构象也受到了成膜组分混合比例的影响，表明胶原蛋白与壳聚糖分子间相互作用强度与胶原蛋白和壳聚糖两者的混合比例有关。[参 考 文 献][1] Ruili Zhang, Bin Wang, Changfeng Chi, et al. 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文章来源：《分子科学学报》 网址: http://www.fzkxxbzz.cn/qikandaodu/2021/0322/713.html